本文原载于《中华医学杂志》2019年第5期
本文作者：赵宗磊杜松沈淑馨罗萍丁守坤王光公王丽霞
病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）是由多种病毒感染引起心肌炎症病变，该疾病临床确诊比较困难，到目前为止，心内膜活检仍然是VMC确诊的金标准，由于心肌活检难度大，并且存在创伤风险，导致其在临床上不能广泛开展[1]。有研究报道，血液外泌体可能在柯萨奇B病毒引起的VMC发病的病理生理机制中扮演重要角色[2]。通过比较心血管疾病患者血浆外泌体差异蛋白质组，有可能筛选出隐藏的生物学信息，这将为寻找敏感特异的生物标志物及新的药物靶点提供新的思路。本研究拟通过差异凝胶电泳（difference gel electrophoresis，DIGE）技术分析正常对照组及VMC患者组血浆外泌体差异蛋白质组，然后通过质辅助激光解吸电离-飞行时间/飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight/time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF/TOF MS）对差异蛋白进行鉴定，挑取VMC相关特异性蛋白进行酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）验证，为筛选VMC相关特异性血浆外泌体标志物提供诊断依据，为VMC的早期诊断提供参考。
对象与方法
一、一般资料
1．对象：
河南省人民医院体检科收集的健康人血浆标本作为健康对照组（Control组，n=50），其中男女各25名，年龄（32±12）岁，肌钙蛋白I（cTnI）（106±78）ng/L，肌酸激酶同工酶（CKMB）（10±5）μg/L，无心血管疾病和其他慢性疾病史。收集2016年1月至2017年12月河南省人民医院心血管内科的VMC患者血浆标本（VMC组，n=50），男女各25例，年龄（32±12）岁，病程（19±10）周，肌钙蛋白I（cTnI）（718±169）ng/L，肌酸激酶同工酶（CKMB）（69±29）μg/L。两组的性别、年龄差异无统计学意义（P>0.05）；两组肌钙蛋白I、CKMB相比较差异有统计学意义（P<0.05）。VMC患者在VMC确诊一周内采集血浆标本。所有健康对照组及VMC患者均签署了知情同意书，并经过河南省人民医院伦理委员会审查批准。
2．诊断标准：
病毒性心肌炎患者均符合2001年全国心肌炎心肌病学术会议拟定的成人病毒性心肌炎诊断参考标准[3]。
3．主要实验仪器及实验试剂：
所有患者的血液标本均利用含有抗凝剂的试管收集，样本采集后轻轻混摇4~6次，然后在4 ℃条件下，离心机离心10 min，吸取血浆上清夜，在-80 ℃超低温冰箱中保存待用。硫酸铵、磷酸、蛋白酶抑制剂、尿素、硫脲、N-三羟基氨甲烷（Tris）、碘乙酰胺、二硫苏糖醇（DTT）、赖氨酸、考马斯亮蓝G-250、质谱级α-氰基-4-羟基苯丙烯酸（CHCA）和三氟乙酸（TFA）均购自美国Sigma公司，2-D Clean up kit蛋白除盐试剂盒、24 cm固相非线性pH干胶条（pH 3~10，NL）、2-D Quant kit蛋白浓度定量试剂盒、DIGE用CyDye荧光标记染料试剂盒（Cy2，Cy3，Cy5）和其他双向电泳相关试剂均购自美国的GE公司。MS级别胰蛋白酶购自美国Promega公司。DALT Six二向电泳仪、双向电泳IPGphor等电聚焦仪、Typhoon Imager 9400多功能信号采集系统、Image scanner Ⅲ扫描系统和Spot Picker自动挖胶系统均购自美国的GE公司，真空冷冻干燥仪购自德国的Chaist公司，ABI 4800基质辅助激光解吸飞行时间-飞行时间质谱仪购自美国的Appied Biosystem公司。0.22 μm的注射器滤筛和ZipTip C18购自美国的Millipore公司。人RBP4 ELISA试剂盒购自中国的Cusabio公司；色谱级甲醇和乙腈（ACN）均购自美国的Thermo Fisher Scientific公司；实验用水均为英国ELGA Utrapure water制水系统制备的超纯水。Optima MAX-XP超速离心机购自美国Beckman coulter公司；Nanosight NS300颗粒跟踪分析仪购自英国Malvern公司。
二、方法
1．血浆外泌体纯化和鉴定：
在提取外泌体之前向1 ml血浆添加1∶500浓度比的蛋白酶抑制剂；将上清液移至一个新EP管中，4 ℃，200×g，离心20 min；将上清液移至新的EP管中，4 ℃，10 000×g，离心30 min去除较大的囊泡；将样品用0.22 μm的注射器滤筛过滤后，进行超速离心，4 ℃，110 000×g（Beckman coulter，Optima MAX-XP）超速离心2 h；用1 ml冷的PBS重悬后再次超速离心1 h，去除上清，用100 μl冷的PBS重悬外泌体；纯化的外泌体置于-80 ℃冰箱冻存备检。取10 μl纯化的外泌体用冷的PBS稀释成1 ml后进行Nanosight NS300粒径分布检测。
2．血浆外泌体的蛋白提取与双向电泳前处理：
取50 μl纯化血浆外泌体，加入500 μl蛋白裂解液（7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，30 mmol/L Tris，4% CHAPS）后震荡溶解10 min，4 ℃，12 000×g离心10 min去除不溶性物质，上清置于-80 ℃冰箱冻存。利用2-D Clean-up kit除盐试剂盒对蛋白样品进行纯化。用2-D Quant kit蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度检测，样品分装后保存在-80 ℃超低温冰箱备用。
3．CyeDye荧光蛋白标记：
按照随机数字表法选取5名Control组对象与5例VMC组患者血浆外泌体蛋白标本，用于DIGE荧光染料标记实验。每个标本各取25 μg混合制成内标，每块胶上样50 μg内标蛋白，利用Cy2染料标记。按照试剂盒说明书，利用Cy2、Cy3、Cy5在避光条件下标记各个实验标本。
4．双向凝胶电泳：
荧光标记的样品混合后，进行蛋白分析胶的上样。将等量各组未进行荧光标记的蛋白混合后，吸取600 μg混合蛋白样品上样，用于蛋白制备胶的上样。分析胶和制备胶均用水化液补齐至总体积450 μl，然后上样至24 cm的IPG干胶条（pH 3~10，NL）。将泡涨后的胶条置于IPGPhor电泳仪上进行一向IEF电泳。IEF电泳结束后，对IPG胶条依次利用DTT-SDS平衡液（10 g/L DTT）与碘乙酰胺SDS平衡液（30 g/L碘乙酰胺）进行平衡反应，15 min每次。将IPG胶条置于12.5%的聚丙稀酰胺凝胶的上端，用低熔点琼脂糖封胶后，用DALT Six电泳仪进行第二向SDS-PAGE电泳。
5．凝胶图像信号采集：
利用Typhoon 9400多功能信号采集仪对每个分析胶进行图像信号扫描，分别设置488 nm/520 nm、532 nm/580 nm和633 nm/670 nm波长激光对Cy2、Cy3和Cy5通道进行信号采集，PMT值以最大信号灰度值在60 000~90 000进行设置。通过ImageQuant TL分析软件观察Cy2、Cy3和Cy5标记蛋白通道的凝胶成像图片。双向电泳后的制备胶采用考马斯亮蓝G-250胶体考染的方法染色，最后，利用Image Scanner的LabScan软件来进行信号采集。
6．差异分析软件处理和挖胶：
利用DeCyder V6.5差异分析软件首先进行胶内差异分析，接着进行胶间差异分析，最后，在制备胶上匹配出差异蛋白编号对应的凝胶位置，利用Spot picker全自动斑点切取仪进行差异点的挖胶。
7．蛋白的胶内酶解与质谱分析：
蛋白斑点先用50 μl脱色液（30% ACN，100 mmol/L NH4HCO3）进行脱色2次，每次10 min，直至考马斯亮蓝的颜色脱尽。弃去上清，向每个EP管内分别加入100 μl的100% ACN脱水5 min后，弃去上清。打开EP管盖子，在通风橱内风干5 min后，加入5 μl牛胰蛋白酶工作液，然后将EP管置于4 ℃冰箱反应30 min，待胶粒充分吸胀后，吸去多余的胰酶。分别加入50 μl的50 mmol/L NH4HCO3缓冲液，放置在37 ℃水浴锅中进行酶解过夜。向酶解的EP管加入100 μl的洗脱液，然后超声10 min，萃取3次。将萃取后的酶解液混合，进行真空冷冻干燥。用10 μl的0.1% TFA溶解肽段后，利用ZipTipC18对酶解肽段进行纯化，取0.5 μl纯化的肽段样品点样至清洁干燥的MALDI样品靶上，然后吸取0.5 μl 5 mg/ml的CHCA基质与纯化的肽段进行混合。将样品干燥后置入MALDI-TOF/TOF质谱仪中，内标校正仪器后进行激光轰击打靶获取肽指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF），并进行二级质谱分析，使用Mascot软件对蛋白的PMF数据进行检索，利用MS/MS二级质谱模式人类Swissprot数据库的搜索。
8．ELISA验证实验：
从提取的血浆外泌体标本库中随机抽取40名Control组的血浆外泌体标本和40例VMC组患者的血浆外泌体标本，进行ELISA实验验证。实验步骤参考ELISA试剂盒操作说明书。
三、统计学方法
实验结果采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，数据采±s来描述，两组间均数比较时采用独立样本的t检验，P<0.05代表差异有统计学意义。
结果
1．血浆外泌体粒径的Nanosight检测：
Nanosight的检测实验报告表明MODE曲线图较流畅，说明本实验纯化的外泌体标本所含的杂质较少，外泌体粒径峰值约为82 nm，与理论上的血浆外泌体大小相符（图1A）；另外，外泌体颗粒的散点图也表明外泌体直径大小集中，主要介于30~150 nm（图1B）。
图1 血浆外泌体Nanosight检测分析A. MODE曲线图；B.颗粒分布图
2．血浆外泌体DIGE图谱：
采集的DIGE信号图谱，利用DeCyder V6.5进行差异分析后发现，Control组和VMC组血浆外泌体蛋白质点分别是1 226±84和1 356±98，等电点主要集中在4~9，相对分子质量主要分布在40 000~90 000。两组间表达差异在2倍以上的蛋白点为差异蛋白点，共确定了10个差异蛋白点，其中在VMC组，有8个蛋白点表达上调，2个蛋白点表达下调（图2）。
图2 病毒性心肌炎患者血浆外泌体差异蛋白分布
3．差异蛋白点的质谱鉴定：
质谱分析发现，酶解蛋白的肽质量指纹图谱背景信号低，出峰信号强，共鉴定出10种差异蛋白质，所有离子评分的可信度均是100%，表明鉴定的结果高度可信（表1）。表达上调的蛋白包括角蛋白2（KRT2）、角蛋白5（KRT5）、角蛋白9（KRT9）、角蛋白77（KRT77）、角蛋白78（KRT78）、锌-α2糖蛋白（AZGP1）、触珠蛋白（HP）和视黄醇结合蛋白4（RBP4）；表达下调的蛋白为CD5抗原样蛋白（CD5L）和补体C1q亚基B（C1QB）。
表1 差异蛋白点的质谱结果
4．RBP4 ELISA验证：
经过统计学软件对ELISA实验结果分析后表明，VMC组患者组血浆外泌体中RBP4蛋白浓度[（148.7±3.9）μg/L]与Control组[（64.5±2.6）μg/L]相比较表达上调（P<0.05，图3），与差异蛋白质组学的实验结果一致。
图3 RBP4的ELISA实验验证（±s，n=40）
讨论
病毒性心肌炎相关的蛋白质组学和生物标志物的研究已经有不少报道。Hammer等[4]通过双向电泳对急性病毒性心肌炎小鼠模型的心肌蛋白质组进行研究，发现了136个差异蛋白点中，无论在VMC急性期还是慢性期，参与机体免疫防御、细胞代谢和蛋白修饰等功能的蛋白质均有明显丰度变化。国内外对VMC诊断用的生物标志物研究包括心肌酶、心肌蛋白、心脏神经激素、抗心肌抗体和心肌特异性microRNA等，但是每种候选标志物的灵敏度和特异性均存在一定缺陷。因此，探索VMC早期诊断的特异性生物标志物将变得非常有意义。
以往对VMC生物标志物的筛选多集中在血浆标本，由于血浆中高丰度蛋白的干扰，极大地降低了发现理想生物标志物的概率。而血浆外泌体中成分简单，排除了高丰度蛋白的干扰，为寻找VMC特异性生物标志物提供了新思路。本研究通过对对照组与VMC患者组的血浆外泌体进行差异蛋白质组学比较，共筛选到8种表达上调的蛋白（KRT2、KRT5、KRT9、KRT77、KRT78、AZGP1、HP和RBP4）及2种表达下调的蛋白（CD5L和C1QB）。通过查阅文献后发现，这些血浆外泌体差异蛋白与VMC的关系未见报道，有可能是候选的VMC诊断的血浆生物学标志物。
VMC血浆外泌体中表达上调的蛋白质组中出现大量的细胞角蛋白家族成员，例如，KRT2、KRT5、KRT9、KRT77和KRT78等。有研究表明，在细胞应激和细胞修复过程中，细胞内角蛋白会出现表达量增高以及翻译后修饰的改变[5]。在VMC患者血浆外泌体中这些细胞角蛋白的升高可能发挥抵御病毒的应激反应，加速心肌细胞修复等作用。
AZGP1是一种与胰岛素抵抗有关的脂肪因子，对脂代谢有重要影响，可以促进脂肪的分解和利用等。有研究报道，AZGP1在气管非结核分枝杆菌性乳腺癌病人的循环外泌体中出现了特异性表达，可以用来对这类疾病进行监控和风险评估[6]。AZGP1在VMC血浆外泌体中明显表达增高，有可能与VMC的机体防御反应相关。
HP属于急性期反应蛋白（APR）家族，当机体处于炎症应激时，APR蛋白在血浆中会出现一系列特征性变化，并且APR蛋白的变化与炎症应激的时间轴有关，因此，APR蛋白的变化可以反映机体病理损伤的性质与范围。有研究表明，HP的血浆浓度在创伤、感染、肿瘤和心肌梗死等急性应激反应期明显表达上调[7]。本研究发现，HP蛋白在VMC患者血浆外泌体中升高，可能与机体的抗炎症应激相关。
RBP4作为一种分泌蛋白，是一种循环性脂肪细胞因子，许多研究发现其于肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、肿瘤、炎症、高血压及动脉粥样硬化等密切相关，并有望为研究相关疾病的发病机制及治疗靶点提供新线索[8,9]。本实验结果表明，RBP4蛋白在VMC患者血浆外泌体中表达增高，可能与机体的抗病毒反应相关。ELISA结果表明，RBP4蛋白表达趋势和DIGE定量蛋白质组学结果一致。因此，RBP4可能是候选的VMC早期诊断的血浆外泌体生物学标志物，但是仍需更进行多批次、高通量及多中心的实验数据来确认。
CD5L是一种可溶性蛋白，属于清道夫受体（SRCR）基因超家族，主要表达在淋巴结巨噬细胞和炎性组织中，除了参与脂质代谢反应外，其主要功能还包括参与免疫平衡及炎症性疾病，已经成为多种疾病的生物标志物[10]。本实验结果发现，CD5L在VMC患者血浆外泌体中表达下调，可能是机体的免疫平衡的失代偿引起的。
C1QB是构成补体的一个亚单位，参与机体免疫复合物的形成。有研究表明，C1QB缺失与系统性红斑狼疮息息相关[11]。Peters等[12]研究报道，C1QB可能是预测2型糖尿病肾功能快速下降的循环生物标志物。本研究发现，C1QB在VMC患者血浆外泌体中表达减少，可能原因是在VMC急性期，血浆中出现大量机体免疫复合物，造成了血浆外泌体中C1QB的下调。
通过比较VMC患者组与对照组血浆外泌体差异蛋白质组，筛选到10种VMC相关的血浆外泌体差异蛋白质，RBP4可能是候选的VMC早期诊断用的生物标志物，但是尚需要扩大样本量来进行验证。总之，本研究将有助于深入理解VMC的发病机制，也为VMC的早期诊断带来新机遇。
利益冲突
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
（参考文献略）
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