利玛窦初到北京时，住在专门接待外国使臣的宾馆中，随后获准在城内择民房长住，并可以进行传教活动。利玛窦选中了宣武门内的一块土地，他在这里修建了一座教堂，这就是著名的南堂——北京地区现存最古老的天主教堂。利玛窦建立南堂之后，在教堂里举办西方图书和科学仪器的展览，吸引了大批官员和儒士前来参观，从而扩大了天主教在士大夫中的影响。
利玛窦在北京交游于士林，结识众多名流，其中不乏朝廷高官，如内阁首辅沈一贯、吏部尚书李戴、礼部尚书冯琦、刑部尚书萧大亨等人。但对利玛窦传教事业帮助最大的，当属“圣教三柱石”——徐光启、李之藻和杨廷筠。
徐光启是南直隶松江府（今上海）人，曾在南京与利玛窦会面，之后入天主教。利玛窦在北京期间，徐光启正供职于翰林院，他与利玛窦结下了深厚的友谊，二人协力翻译了《几何原本》和《测量法义》等著作。李之藻是浙江仁和（今杭州）人，时任太仆寺少卿。他师从利玛窦学习西方科学，之后也加入了天主教。他与利玛窦合作编译了《同文指算》等书籍。杨廷筠是李之藻的同乡，在北京担任监察御史。杨廷钧早年是虔诚的佛教徒，后在利玛窦和李之藻等人的感召下受洗入教。“圣教三柱石”身体力行实践教义，他们劝说家人、朋友入教，为传教士提供经费，并且在天主教遭受教难之时上疏抗辩，极力保护传教士。
通过利玛窦的不懈努力，天主教在中国得以传播。利玛窦留居北京之后，全国教徒人数骤增，涵盖了平民、士大夫、皇亲国戚等各个阶层。与此同时，西方的科学技术伴随天主教传入中国，中国的文化也由传教士们带到西方。
1610年，利玛窦在北京去世，终年59岁。按照当时惯例，西方传教士死后本应移葬澳门。但在内阁首辅叶向高等人的斡旋下，万历皇帝破例准许利玛窦葬于北京西郊的藤公栅栏，使其成为首位葬于北京的西方传教士。400年过去了，如今的利玛窦墓依然静卧于松柏之间，诉说着这位文化使者与北京的不解之缘。
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